МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ 2 страница Главная страница сайта Об авторах сайта Контакты сайта

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ 2 страничка


.

Дробную стерилизацию питательных сред проводят в аппарате Коха или в автоклаве с закрытой, но не завинченной крышкой. Так как нагревание ведут в парах кипящей воды, способ называют стерилизацией текучим паром. Дробной стерилизации подвергают среды, в состав которых входят сахара, многоатомные спирты, желатин.

Стерилизация путем прерывистого нагрева была предложена английским физиком Джоном Тиндалем и получила название тиндализации. Среды необратимо изменяющиеся при кипячении, осторожно прогревают при более низкой температуре: при 60-80 ºC в течение 5 сут подряд по 30-60 мин или при 56-58 ºC на протяжении 6-7 сут, в первые сутки – 2 ч, в последующие – по 1 ч. Температурную обработку сред ведут на водяной бане или в ультратермостате, где температура автоматически поддерживается на определенном уровне с помощью специального устройства. В промежутках между нагревами среды выдерживают в обычном термостате при 30 ºC.

Пастеризация. Пастеризация, или неполная стерилизация, предложена Луи Пастером. Она предназначена для уничтожения в основном аспорогенных микроорганизмов однократным прогреванием при температуре 60-75 ºC и выдержке 15-30 мин или при 80 ºC в течение 10-15 мин. Пастеризации подвергаются продукты и среды, которые при воздействии боле высоких температур претерпевают глубокие изменения, теряют качество и питательную ценность. Пастеризацию широко применяют в пищевой промышленности.

Стерилизация фильтрованием. Стерилизацию жидких питательных сред, не выдерживающих даже незначительного нагревания, производят фильтрованием через специальные мелкопористые бактериальные фильтры. На бактериальных фильтрах задерживаются механические взвешенные примеси, в том числе и клетки микроорганизмов. Исключение составляют вирусы и фаги. Фильтрованию подвергают среды с белками, антибиотиками, витаминами, летучими веществами, а также культуральные жидкости с целью освобождения от клеток и сохранения всех продуктов метаболизма в неизменном виде. Фильтры изготавливают из положительно заряженных материалов.

Техника приготовления основных питательных сред

Для культивирования микробов в лабораторных усло­виях готовят питательные среды с учетом потребности в питательных веществах каждого вида в отдельности. Питательная среда в своем составе должна содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, серу, магний, железо, микроэлементы и биостимуляторы роста.

Различают питательные среды естественные (молоко, яйца, картофель и т. п.), искусственные, приготовленные из продуктов животного или раститель­ного происхождения, и синтетические (среды Чапека, Сабуро). По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар или желатин. Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей рода анфельция, состоящий в основном из полисахаридов. В холодной воде агар-агар набухает и размягчается, в горячей (90—100° С) расплавляется, образуя клееобразную массу. Застывает агар-агар при 40° С, образуя студень. Как питательное вещество агар-агар микробами не используется.

Желатин получают путем вываривания кожи, костей и сухожилий животных. При нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывающий при 18—20° С в однородный коллоидный студень и рас­плавляющийся при 25—27° С.



В бактериологической практике обычно применяют среды из продуктов животного и растительного происхождения, содержащие пептоны, экстрактивные вещества мяса, кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т. п.

Необходимые питательные вещества должны содержаться в среде в доступной форме и в определенных соотношениях.

Питательные среды должны быть стерильными (должно быть обеспечено получение чистых культур микроорганизмов), прозрачными (выросшие на них мик­роорганизмы должны быть хорошо видны и иметь опре­деленную величину рН).

Хранят готовые среды в прохладном месте, в плотно закрывающихся шкафах или ящиках, что предохраняет их от быстрого высыхания. Надолго хранившихся средах микробы развиваются слабо или совсем не растут.

Питательные среды принято делить на три группы:

1) стандартные (универсальные) — предназначаются для культивирования большинства микробов;

2) специальные элективные, избирательные — предназначаются для выращивания только определен­ного вида микробов, рост других микроорганизмов на этих средах подавляется;

3) дифференциально-диагностические — предназначаются для изучения биохимических свойств микробов с целью дифференцирования различных видов микроорганизмов.

СТАНДАРТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Мясопептонный бульон (МПБ). В состав МПБ входят мясная вода, пептон и поваренная соль. Для приготовления мясной воды используют свежее мясо крупного рогатого скота или лошадей. Мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водой из расчета 1:2 (например, 1 кг фарша заливают 2 л воды). Ставят на 18—20 ч в прохладное место (4—6° С), затем кипятят в течение часа и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема, разливают его по колбам или бутылям и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Или заливают двукратным количеством воды, кипятят в тече­ние часа, дают остыть, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема и стерилизуют его в течение 30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

Загрузка...

При варке мясной воды на поверхности жидкости появляется некоторое количество жира, который необхо­димо снять.

Для приготовления МПБ к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистой поваренной соли, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2—7,4 прибавлением щелочи или двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон должен быть цвета соломы и совершенно прозрачным. Бульон разливают по пробиркам и колбам, закрывают ватными пробками, пробки обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют 20—30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

Мясопептонный агар (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агар; нагревают в автоклаве или в текучепаровом аппарате до полного расплавления агар-агара. Устанавливают рН 7,2—7,4. Дают остыть до 50° С, осветляют путем добавления белка одного куриного яйца, разведенного двойным количеством дистиллированной воды . Ставят на 20 мин в автоклав при избыточном давлении 0,1 МПа для свертывания белка и тем самым осветляют среду, фильтруют через слой марли и ваты (рис. 1). Можно пользоваться другой методикой. К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агара, нагревают до полного расплавления его. После остывания застывший плотный агар вынимают из посу­ды и отрезают нижнюю часть, содержащую осадок. За­тем вновь расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы прозрачность агара позволяла свободно читать напечатанный на бумаге шрифт при наложении на него бактериологической чашки с агаром, налитым слоем толщиной 20 мм. После стерилизации для того, чтобы агар в пробирках застыл столбиком, их оставляют в вертикальном положении. Если нужно при­готовить агар скошенной формы, пробирки с расплавлен­ным агаром располагают в наклонном положении так, чтобы среда заняла две трети пробирки, и в таком виде оставляют до застывания среды (рис. 2). При этом про­бирки необходимо предохранять от действия солнечного света.

Мясопептонный желатин (МПЖ). К мясопептонному бульону добавляют 10% зимой и не менее 18—20% летом измельченного желатина и подогревают в текучепаровом аппарате до полного растворения желатина. Подщелачивают среду до рН 7,2 путем добавления 10%-ного раствора NaОН. После охлаждения до 60° С осветляют яичным белком (в таком же количестве, как и для МПА), подогревают в текучепаровом аппарате 20—30 мин. В горячем виде фильтруют через ватный или марлевый фильтр и разливают по пробиркам. Стери­лизуют дробно по 15—20 мин три дня подряд при температуре 100° С.

Картофельная среда. Отбирают крупный картофель, промывают щеткой под водопроводной водой, удаляют кожуру и поврежденные места. Клубни снова моют под струей водопроводной воды и помещают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на 2—3 ч для ней­трализации кислой среды. Из картофеля пробником вырезают столбики, диаметр которых должен соответство­вать ширине пробирок. Столбики помещают в чашки с водой и разрезают по диагонали на две части, подсуши­вают фильтровальной бумагой и половинки помещают в пробирки с перехватом внизу (в нижнюю часть этих пробирок стекает вода, выделяемая при стерилизации). За неимением специальных пробирок используют обыч­ные пробирки, поместив на дно стеклянные или деревян­ные палочки, а на них — картофель. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20—25 мин.

Пептонная вода. Приготовляют ее различными способами. В 1 л дистиллированной воды растворяют 5 г химически чистой поваренной соли и 10 г пептона и сте­рилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 10 мин. Для выращивания гнилостных бактерий пептонную воду готовят несколько иначе: в 1 л ди­стиллированной воды растворяют 30 г пептона. Стерили­зуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Концентрированная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 100 г пептона и 50 г поваренной соли, нагревают до кипения, отфильтровывают, добавляют 50 г глюкозы, устанавливают рН 7,4— 7,6 (с помощью насыщенного раствора углекислой соды), разливают по 10 мл в колбы и склянки емкостью 250 мл с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром. Разведенная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 10 г пептона и 5 г поваренной соли, нагревают до кипения и добавляют 5 г глюкозы. Устанавливают рН среды 7,4—7,6, разливают по 10 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром.

Сухой питательный агар. Содержит рыбный или мясной бульон, агар, хлористый и фосфорнокислый натрий. К 5 г порошка агара добавляют 100 мл холод­ной дистиллированной воды. Тщательно взбалтывают и нагревают при помешивании до полного растворения агара, не допуская пригорания. По мере надобности раствор фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ (ЭЛЕКТИВНЫЕ) ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Среды для выращивания анаэробных микробов. Мясопептонный печеночный бульон Кита - Тароцци (МППБ).Свежую или замороженную пе­чень (лучше крупного рогатого скота) режут на мелкие куски, заливают равным по массе количеством водопроводной воды, варят в течение часа, фильтруют через ва­ту и добавляют к 1 части полученного экстракта 3 части мясопептонного бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют химически чистую поваренную соль (на 1 л среды 1,25 г) и доводят рН до 7,6—7,8, после чего кипя­тят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный или увлажненный ватный фильтр. К профильтрованному бульону добавляют мелко нарезанные кусочки (по 1,5— 2 г) печени, из расчета на 1 л бульона 100 г печени (печень предварительно очищают от пленок и промыва­ют водой). В пробирку помещают несколько таких ку­сочков, наливают высоким столбиком 7—10 мл бульона, на поверхность его наслаивают вазелиновое или парафи­новое масло.

Бульон с кусочками печени стерилизуют под избы­точным давлением 0,1 МПа втечение 30 мин. С целью удаления из пробирки кислорода перед посевом среду кипятят 10 мин и быстро охлаждают водой.

Полужидкий агар для анаэробов. К МПБ добавляют 0,25—0,75% агар-агара и 1% глюкозы; рН среды 7,4. Среду разливают высокими столбиками в про­бирки. Стерилизуют дробно текучим паром по 15—20 мин в течение 3 дней.

Среды для выращивания молочнокислых бактерий. Молоко (цельное). Нагревают до кипения. Наливают в тубусную склянку и ставят на 10—20 ч в холодное место для отстаивания сливок. По истечении этого вре­мени через кран тубуса разливают обезжиренную часть молока по пробиркам, закрывают ватными пробками. Стерилизуют дробно при 100° С три дня по 20 мин или при 112° С однократно 30 мин.

Обезжиренное молоко. Для получения обез­жиренного молока цельное молоко сепарируют и далее поступают так же, как при использовании цельного молока.

Гидролизованное молоко (по Богданову). Берут 1 л прокипяченного иостуженного до 45° С обезжиренного молока, устанавливают рН 7,6—7,8, добавляют 0,5 г порошка панкреатина (разведенного предвари­тельно в небольшом количестве теплой воды) или 2—3 г измельченной поджелудочной железы и через несколько минут 5 мл хлороформа. После этого бутыль тщательно встряхивают, плотно закрывают корковой пробкой и по­мещают на 3 суток в термостат при температуре 40° С при ежедневном встряхивании жидкости. По истечении указанного срока с целью удаления хлороформа бутыль открывают, жидкость фильтруют и разбавляют в 2—3 раза водопроводной водой. Доводят рН среды до 7,0— 7,2 и стерилизуют.

Агар из гидролизованного м о л о к а. К гидролизованному молоку прибавляют 1,5—2% агара, рас­плавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа втечение 15 мин. На этой среде хорошо растут молочнокислые палочки.

Сывороточный агар. На 100 мл водопроводной воды берут 7,5 г агара, кипятят до полного растворения, добавляют воды до первоначального объема (т. е. в объе­ме, равном объему испарившейся воды), прибавляют 400 мл заранее приготовленной молочной сыворотки, подвергают действию текучего пара в течение 30 мин, фильтруют через слой ваты, разливают по пробиркам истерилизуют под давлением 0,05 МПа в течение 30 мин.

Капустная среда. 200 г измельченной капусты (или люцерны) заливают 100 мл воды и кипятят в кастрюле 10 мин, отжимают через двойной слой марли. Полученную жидкость фильтруют и разводят в 2 раза водопроводной водой. Добавляют 2% глюкозы и 1% пептона, разливают по пробиркам и стерилизуют три избыточ­ном давлении 0,05 МПа в течение 15 мин.

Среда для выращивания осмофильных дрожжей. Примерно в 1 л дистиллированной воды вносят 200 г предварительно подогретого меда, 1 г двуфосфорнокислого калия, 0,5 г сульфата магния, 0,5 г виннокислого аммония, 0,1 г хлористого натрия и 0,1 г хлористого ка­лия. Все компоненты смешивают и стерилизуют под из­быточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среда для выращивания галофилов. Используют обычные мясопептонные среды с добавлением от 10—15 до 20—30% поваренной соли. Кроме того, при изготовле­нии плотных питательных сред увеличивают и процент­ное содержание агара. Стерилизацию проводят под из­быточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среды обогащения. Среда Мюллера. К 4,5 г химически чистого мела, предварительно простерилизованного сухим жаром, добавляют 90 мл МПБ и стери­лизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение-20 мин. Готовят: а) раствор гипосульфита (50 г чистого кристаллического гипосульфита заливают до 100 мл дистиллированной водой, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин); б) раствор йода (20 г металлического йода и 25 г йодистого калия заливают до 100 мл дистил­лированной водой). Перед посевом к бульону с мелом стерильно добавляют 10 мл раствора гипосульфита и 2 мл раствора йода. При добавлении каждого ингредиента смесь взбалтывают. Разливают по стерильным пробиркам или колбам.

Среда Киллиана. К 100 мл обычного МПБ стерильно добавляют перед использованием 1 мл водного раствора (1:1000) бриллиантового зеленого.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ (ЦВЕТНЫЕ) ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Среда Эндо. К 100 мл нейтрального расплавлен­ного 3%-ного мясопептонного агара прибавляют 1 мл 10%-ного водного раствора кристаллического углекисло­го натрия, выдерживают в текучепаровом аппарате в те­чение10 мин при температуре 100° С, охлаждают до 60° и стерильно прибавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, и смесь фуксина с безводным сульфитом натрия. Смесь готовят следую­щим образом. Растворяют 0,5 г сульфита натрия в 5 мл стерильной воды и добавляют к 1 мл насыщенного спир­тового раствора основного кристаллического фуксина до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка розоватой. Обесцвеченную смесь фуксина с сульфитом добавляют к расплавленному агару, и последний прини­мает розоватый цвет. После тщательного перемешивания (следят за тем, чтобы не образовывалась пена) среду разливают по чашкам. При остывании среда делается цветной, в толстых слоях имеет розоватый оттенок. На этой среде можно легко отличить кишечную палочку, паратифозных бактерий.

Готовят среду перед посевом. Во избежание покраснения ее защищают от света. Выпускается в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на этикетке.

Среда Гисса. Для изготовления индикатора Андредэ берут100 мл дистиллированной воды, 0,5 г фуксина кислого и 16 мл 4%-ного водного раствора едкого натра. Выдержи­вают на водяной бане 10 мин. Хранят в темном месте.

Среду с индикатором Андредэ приготовляют следую­щим образом. Готовят пептонную воду. Для этого берут 1% пептона и 0,5% поваренной соли на определенный объем дистиллированной воды. Кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный складчатый фильтр, устанавливают рН 7,0—7,2. После подщелачивания 10%-ным раствором NаОН снова кипятят в течение 10 мин, фильтруют и к готовой 1%-ной пептонной воде (рН 7,0—7,2) добавляют 1% индикатора Андредэ. К среде с индикатором добавляют требуемые углеводы или многоатомные спирты в количестве 0,5% — 1% (лак­тозу, глюкозу, сахарозу, маннит, дульцит и др.). Среды разливают по пробиркам, снабженным для учета обра­зования газа бродильными трубочками. Вместо трубо­чек иногда помещают кусочки ваты — 0,02 г на пробир­ку. Проводят дробную стерилизацию при температуре 100° С в течение 20 мин три дня подряд.

Правильно приготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет.

Среда Кесслера. В 1 л водопроводной воды вносят 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Кипятят на водяной бане 15 мин, постоянно взбалтывая. После полного растворения среду фильтруют через вату и добавляют 10 г лактозы. Доводят рН до 7,7. К 1 л среды добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливают в пробирки с поплавками. Стерили­зуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Для культивирования микробов на искусственных питательных средах особое значение имеет концентрация водородных ионов, так как каждый вид микроба может развиваться только при определенной кислотности или щелочности. Большинство бактерий приспособлено к росту и размножению в нейтральной или слабощелочной среде (рН 7,0—7,6).

Для определения реакции питательной среды применяют два метода: электрометрический (с помощью рН-метра) и колориметрический. В лабораторной прак­тике чаще всего используется наиболее простой колориметрический метод по Михаэлису, основанный на изменении цвета индикатора вследствие диссоциации его в зависимости от концентрации водородных ионов в среде. При определении рН по Михаэлису применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Ввиду того, что для выращивания микробов готовят среды слабощелочной реакции, при определении рН среды в качестве индикатора используют метаннитрофенол, который позволяет определять рН в пределах от 6,8 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Контрольные вопросы:

1. Состав питательных сред.

2. Как культивируют в лабораторных условиях микроорганизмы?

3. Какие бывают питательные среды по консистенции?

4. Как различают питательные среды по происхождению?

5. Плотные питательные среды и их характеристика.

6. Сухие питательные среды и их характеристика.

7. Углеводные питательные среды, их характеристика.

8. Автоклавирование.

9. Стерилизация текучим паром.

10. Пастеризация.

11. Стерилизация фильтрованием.

12. Как готовят МПБ, МПЖ, МПА?

Лабораторная работа № 4

Тема: Методы посева и культивирование продуцентов.

Цель работы: Дать студентам представление о способах культивирования продуцентов, как самостоятельного разряда микроорганизмов, Ознакомить студентов с поверхностными и глубинными способами посева микроорганизмов, аэробными и анаэробными методами культивирования. Научится проводить посев на плотные и жидкие питательные среды.

Задание:

1. Изучить технику посева на питательные среды.

2. Сделать посев и пересев на жидкие питательные среды.

3. Провести посев на плотные питательные среды

- на скошенный мясо-пептонный агар;

- уколом в столбик питательной среды;

- петлей на среду в чашку Петри;

- шпателем или тампоном на среду в чашку Петри;

- в толщу питательной среды.

4. Изучить образовавшиеся колонии. Определить морфологию микроорганизмов.

5. Приготовить мазки и окрасить по Граму.

6. Промикроскопировать полученные препараты.

7. Зарисовать увиденное в микроскопе в тетрадь.

8. Оформить отчеты и ответить на контрольные вопросы.

Материалы и оборудование:Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт – Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева; бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один стерильный завернутый шпатель на двух студентов; насос Камовского, эксикатор, анаэростат, карандаши по стеклу.

Теоретическая часть.

Для выделения культуры микробов из исследуемого материала (молока, мяса, воды, почвы и т. д.) в лабора­торных условиях используют метод посева и пересева. Посевом называется внесение части исследуемого мате риала в чистую, стерильную питательную среду, пересе­вом— перенос части выросшей на питательной среде культуры микробов на другую, свежую стерильную пи­тательную среду (рис. 1).

П о с е в на плотную питательную среду. Техника посева зависит от консистенции питательной среды, на которой желают вырастить культуру микробов. Посев производят с помощью бактериологический петли и иглы или пипетки Пастера.

Рис. 1. Пересев из одной пробирки в другую

С целью предупреждения загрязнения среды микрофлорой воздуха пробир­ки держат наклонно над пламенем горелки или спиртов­ки. Далее поступают следующим образом:

1) в левую руку берут пробирку с микробной культурой и пробирку со стерильной питательной средой и держат в наклонном положении между большим и указательным пальцем; в правой руке держат петледержатель в вертикальном положении над пламенем горелки, прокаливают петлю до появления красного цвета, затем наклоняют горизонтально и 2—3 раза быстро проводят через пламя петледержатель;

2) взяв мизинцем и безымянным пальцами правой руки наружный конец ватной пробки, вынимают около пламени пробку из пробирки, после чего обжигают края обеих пробирок. Следят за тем, чтобы пробки ни к чему не прикасались;

3) вводят петлю в пробирку с микробной культурой. Для охлаждения петли нужно сначала прикоснуться к поверхности агара, где нет культуры, после чего осторожно снимают небольшое количество культуры или каплю жидкости (если среда жидкая) и быстро переносят (не прикасаясь к стенкам пробирки!) во вторую про­бирку со стерильной питательной средой; петлю опускают до конденсационной воды, находящейся на дне пробирок со свежими средами, и делают посев культуры одним из трех способов:

посев штрихом — проводят зигзагообразную линию, свободно скользя петлей по поверхности среды от одного края пробирки к другому;

посев чертой — проводят петлю по прямой линии посредине поверхности питательной среды;

посев сплошной — растирают материал непрерыв­ными круговыми движениями по всей поверхности пита­тельной среды;

4) вынимают петлю, обжигают края пробирок и внут­ренние концы пробок (если пробки загораются, дуть на них ни в коем случае нельзя); следует быстро ввести их в пробирки, наружный конец гасят рукой или пинцетом;

5) прокаливают петлю на пламени и ставят ее на место;

6) па пробирке карандашом или чернилами по стек­лу ставят дату посева, название культуры микроба.

В столбики МПЖ или МПА сеют уколом (рис. 2). С этой целью стерильной иглой с набранным на нее ма­териалом прокалывают столбик агара или желатин в средней части, следя за тем, чтобы игла нигде не подхо­дила к стенкам пробирки. Не доводя на сантиметр до дна пробирки, иглу извлекают, обжигают на пламени спиртовки до красного каления (убивают оставшихся на петле микробов), после чего край пробирки еще раз об­жигают на огне, проводят через пламя пробку и закры­вают пробирку. Край пробирки во время посева держат, не отнимая, около огня, фиксируя левую руку в этом по­ложении упором о край стола. Бактериологическую пет­лю помещают в штатив, а пробирку, отметив на ней номер экспертизы, дату посева и место, откуда был взят материал, помещают в термостат.

Посев в жидкую среду. При посеве в жидкую питательную среду стерильную бактериологическую пет­лю с набранным на нее материалом вносят в пробирку с соблюдением всех предосторожностей, описанных выше. Материал тщательно растирают по стенке пробирки у верхнего края среды, все время смывая его средой. При посеве пастеровской (рис. 3) пипеткой поверхность обжигают на пламени спиртовки, охлаждают, отнеся в сторону от огня, затем обломав стерильным пинцетом запаянный конец, набирают в нее материал, быстро вносят в пробирку и производят посев так же, как это делают петлей, соблюдая правила стерильности.

Рис. 2 Посев уколом Рис. 3. Пользование пипеткой Пастера

После использования пипетки ее помещают в сосуд с дезинфи­цирующей жидкостью (5%-ным раствором карболовой кислоты или др.).

Методы культивирования анаэробов.Для культивирования анаэробов на искусственных питательных сре­дах требуется поддерживать в среде анаэробные условия не только в момент посева, но и в период их роста.

Для создания анаэробных условий применяют физический, химический, биологический и комбинированный методы.

Физический метод. В жидких питательных средах (Китт- Тароцци) анаэробные условия создаются путем:

а) удаления поглощенного средой кислорода ки­пячением в течение 10—15 мин с последующим быстрым охлаждением под струей холодной воды, после чего тотчас же производят посев и помещают в термостат;

б) заливки поверхности жидкости слоем индифферентного масла (вазелинового, па­рафинового), прекращающим доступ в среду атмосфер­ного воздуха;

в) разливка среды в узкие пробирки высоким столбиком;

Рис. 4. Культура анаэробов в чашках Петри, помещенных в эксикатор, соединенный с масляным насосом

г) добавления к жидким средам до их стери­лизации кусочков печени, мышц, картофеля, яичного белка, а, также углеводов (глюкозы и др.), расщепляе­мых анаэробами в процессе размножения.

Анаэробные условия создаются путем удаления воз­духа из анаэростатов или эксикаторов (рис. 4) или за­мене его каким-либо индифферентным газом (водоро­дом, углекислым газом, азотом). Снижения давления воздуха в эксикаторах и анаэростатах до 0,0001 МПа (1 мм рт. ст.) путем выкачивания его при помощи ва­куум-насоса под контролем ртутного манометра доста­точно для выращивания строгих анаэробов. На дно эксикатора для поглощения избытка влаги помещают 20—30 г сухой поваренной соли или 5—6 г хлористого кальция. Анаэростат представляет собой металлический Цилиндр с герметически закрывающейся крышкой и кра­ном, посредством которого он присоединяется к насосу. После выкачивания воздуха кран закрывают, и анаэро­стат помещают в термостат.

Атмосферный воздух из герметически закрытых сосудов часто вытесняют каким-либо другим, индифферентным газом (например, водородом или азотом).

Химический метод. Химический метод основа на химической реакции, протекающей в герметически замкнутом сосуде, где происходит связывание свободного кислорода воздуха.


Другие страницы сайта


Для Вас подготовлен образовательный материал МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ 2 страница

5 stars - based on 220 reviews 5
  • 1,25 ч
  • 1-гемоцитобласт; 2-миелобласт; 3-эритробласт; 4-эритроциты; 5-лимфоциты; 6-моноциты; 7-нейтрофильный миелоцит; 8-сегментоядерный эозинофил; 9-монобласт; 10-промиелоцит; 11-базофильный нормобласт;
  • Константы нестойкости комплексных ионов
  • И поем тропари сия в понедельник и в среду вечера, во глас 2.
  • 1) однополупериодный выпрямитель
  • 1. Аданикова Галина Викторовна
  • Только большинство людей не знают, как найти и развить свои таланты. А вместо этого поступают в ВУЗы на перспективные факультеты и выбирают делом своей жизни не интересную им профессию.
  • 1. Решить систему по формулам Крамера: